合成相關問題
發布時間:2021-08-04脫鹽(DSL) 合成完成的寡核苷酸通過高純氨氣混合水蒸汽,在高溫高壓下將連接在CPG上的引物切下來后通過普通相層析柱進行層析除鹽。
Cartrige純化 Cartrige純化是通過反相凈化介質 (Reverse Phase Cartridge) 對引物進行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，Cartrige是一種有效并且更加經濟的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質如 C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉。
PAGE純化 PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈Oligo DNA (大于50 mer)的純化特別有效。
HPLC純化 HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA進行純化。該方法用于分離純化或分析時能達到很高的純度和靈敏度。在引物DNA的分析和純化中，常用的是反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：純度大于90%； HPLC純化主要用于修飾引物的純化。該法的缺點是成本較高，批量生產效率不高。
2.如何測定引物的OD值？
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。
3.怎樣溶解引物？
我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘 的轉速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。
4.合成的引物應如何保存?
沒有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進行實驗。
5.如何檢測引物的純度？
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結構條帶)。
6.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團嗎?
沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時請特別注明，此時需收取磷酸化的費用。
7.合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎么辦?
PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。
1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結構.
3) PCR反應用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應條件是否合適?
如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。
8.測定了引物的OD值后發現A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?
由于核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質在280nm附近有強吸收，從生物體內提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數不同，因此不同堿基構成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.
9.如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？
用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應？ 一般來講，20個堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數混合，總體積不要超過500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產物可以放在4度待用。
10.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發現有很多條泳帶，為什么?
對引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復雜的立體結構，因此進行Agarose電泳時，容易出現多條泳帶，更無法用Agarose電泳進行定量了。
11.能否根據引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進行定量?
不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。
12.2OD的引物可以多少做次PCR反應？
一般來講，20個堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。
13.引物在常溫下運輸，會降解嗎？
不會降解，干燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。
14.合成的熒光標記探針應如何保存?
1) 熒光探針必須避光保存。
2)干品請于-20℃保存。
3) 強烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩定，保存時間更長。通常，將探針配制成100 pmol/ul的儲備液，分裝成幾份 (避免反復凍融)，于-20℃保存。使用前，將配制好的儲備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。
15.電泳時，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?
1) A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
2) DNA的立體結構不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。
16.PCR產物經克隆后測序發現，引物處的堿基有錯誤，怎么辦?
1) 因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，會得到正確的結果。
2) 如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費重新合成引物。
17.進行蛋白表達實驗數個月不成功，后經測序發現引物處有錯誤，怎么辦?
1) 表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證。
2) 我們可以免費重新合成引物。
3) 如進行索賠時，按國際行業慣例，索賠范圍限于制品價格范圍之內。
18.G到A的轉換。 上述各種原因產生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對40 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?
1) 合成Oligo DNA時，選用高純度級制品。
2) 避免使用過長的Oligo DNA，最好選用小于35 mer的合成DNA制品。
3) 進行克隆實驗時，每次克隆都須進行測序驗證，以保證序列的正確性，然后再進行進一步實驗。進行蛋白表達實驗時，尤其需要注意。
19.平端的PCR產物難以克隆，為什么?
由于一般的PCR用引物的5′末端都沒有磷酸基團，因此，擴增后的PCR產物的5′末端也沒有磷酸基團。當克隆于去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進去；而當克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對PCR產物的5′端進行磷酸 (PO4修飾) 化處理。
20.進行反義核酸實驗時，是否要對DNA鏈全部進行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內的穩定性?
DNA經S代修飾后比較穩定，在細胞中不會被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩定性，但會降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數個(通常3個)S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩定性，又能增加反義DNA與靶序列的結合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動物體內，為增強穩定性，還是將整條鏈S代效果更好。
21.FITC、6-FAM、5-FAM標記之間有何區別?
它們皆是熒光素標記 (Fluorescein)，5-FAM與6-FAM互為異構體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發色團均為熒光素，通常使用中沒有區別。
22.淬滅基團為TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標記熒光探針在使用上有什么不同?
由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記熒光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱"TaqMan"探針，用于Real Time PCR實驗。由于這些淬滅染料的光譜學性質不同(見下圖)，作為淬滅基團使用時的特點也不同，現說明如下：
1) TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時，自身會在更高波長處發射熒光，此發射熒光會對報告基團的檢測造成影響，探針熒光本底 (Background)相對較高。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團，但自身不發射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測靈敏度更高。
2) 淬滅基團對報告基團的淬滅有賴于二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報告基團的熒光光譜應與淬滅基團的吸收光譜相交搭。對比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團種類比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報告基團種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標記熒光探針用于多重PCR(Multiplexing PCR)。
23.TaqMan 探針設計時應遵循哪些原則?
1) 探針應位于兩引物之間；
2) 探針中堿基G、C的含量應在20%～80%之間；
3) 避免同種堿基成串出現，特別是堿基“G”；
4) 堿基G不要出現在5’末端；
5) 探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應在68～70℃之間；
6) 探針長度超過30個堿基時，最好把淬滅基團放在中間，以防止熒光本底過高，這時探針的3’末端應加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應過程中延伸。
24.何謂分子信標 (Molecular Probes)？與普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什么特殊性？
Molecular Probes是一類特殊的雙標記探針，通常狀態下，其兩末端互補配對，形成莖-環結構 (發卡環結構)，發卡環結構迫使分別連在兩末端的報告基團與淬滅基團緊密鄰近 (此時檢測不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報告基團與淬滅基團分開，Molecular Probes變得明亮起來，可檢測到熒光。由于發卡環結構的存在，探針對靶序列檢測的特異性增強，相對于普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對SNP有更強的識別能力，能區分序列上僅相差一個堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測。此外，Molecular Probes也應用于活體細胞內的mRNA雜交、RNA加工、及轉錄過程的時時監測研究等。
