測序相關問題
發布時間:2021-08-04Q1:DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL測序的準確程度如何？
DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下：1.定量：對樣品及引物進行定量。
2.測序反應：在反應體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應。
3.讀取數據：根據熒光的不同，讀取被測樣品的堿基序列。
ABI公司目前承諾測序結果在800bp以內準確率為98.5%。
Q2:為什么在測序報告上找不到我的引物序列？
1. 如果您提供的樣品是PCR產物，在測序報告上找不到您的引物是正常的。這是因為測序反應是通過對被熒光標記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒有熒光標記，因此自然在測序結果中就不會被識別。有兩種方法可以得到您的引物序列。對于較短的PCR產物（<800bp），可以用另一端的引物進行測序，從另一端測序可以一直測到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補序列。對于較長的序列，一個測序反應測不到頭，因此就只能將您的PCR產物片段克隆到適當的載體中，用載體上的通用引物進行測序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產物的完整序列，最好克隆后進行測序。2. 如果您提供的樣品是質?；蚓?，PCR產物用載體克隆后，由于克隆的方向是隨機的，因此，當您在一條鏈上找不到您的引物序列時,請嘗試在互補鏈上尋找您的引物序列。
3. 當測序引物離您的插入片段很近時，有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區的序列不好，可能無法找到您的引物完整序列。
4. 有時，質粒做模板進行測序時，由于某些原因，質粒上沒有插入外援片段，為空載體，所測的序列完全為載體序列，此時自然也找不到引物序列。
Q3:我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結果？
用于測序的引物比用作PCR反應的引物要求高，以下是不適合用于測序反應的引物類型：
1.不純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會直接造成嚴重的背景峰，因此用于測序的引物序列長度一般在24個堿基之內，因為過長的引物純度不易保證。2.簡并引物，隨機引物和有特殊標記的引物。
