全基因合成相關問題
發布時間:2021-08-04
核酸換算
1. 摩爾數與質量
1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol
1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol
1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol
1 μg lambda phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol
1 μg M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.21 pmol
1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol
1 μg pUC18/19 DNA (2,686bp) = 0.57 pmol
1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg
1 pmol M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 4.78 μg
1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg
1 pmol pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.77 μg
1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg
1 pmol lambda phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg
1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg
2.光吸收值與濃度
1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml
1 OD260 ssDNA = 33 μg/ml
1 OD260 ssRNA = 40 μg/ml
3.分子量
1個脫氧核糖核酸堿基的平均分子量為333 Daltons
1個核糖核酸堿基的平均分子量為340 Daltons
4.核酸末端濃度
線性DNA：pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)
環狀DNA：pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2
1 μg 線性1,000bp DNA = 3.04 pmol ends
1 μg 線性 FX174 DNA (5,386bp) = 0.56 pmol ends
1 μg 線性 pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.14 pmol ends
1 μg 線性 SV40 DNA (5,243bp) = 0.58 pmol ends
1 μg 線性 pBR322 DNA (4,361bp) = 0.7 pmol ends
1 μg 線性 lambda phage DNA (48,502bp) = 0.06 pmol ends
1 μg 線性 M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.42 pmol ends
核苷酸的換算
1.分子量MW (Da) = 333 ′ N (number of bases)
2.濃度
C (mmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 ′ N) C (ng/ml) = OD260 ′ MW / (0.01 ′ N)
注：MW —— molecular weight；N —— number of bases；OD260 —— absorbance at 260 nm
3.雙鏈DNA與寡核苷酸的熔點：
短于20bp的雙鏈寡核苷酸：Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
長于20bp的雙鏈寡核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) –(600/N)
注： N —— 引物的長度(以堿基數計算)；J+ —— 單價陽離子濃度
4.DNA與表達蛋白之間分子量換算
1 kb DNA = 333 amino acid ≈ 3.7 ′ 104 Da
10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA 30,000 Da Protein ≈ 810 bp DNA
50,000 Da Protein ≈ 1350 bp DNA 100,000 Da Protein ≈ 2700 bp DNA
(2)酶促合成：此法又稱基因的半合成法。全基因合成，特別是較大的基因的全部化學合成成本昂貴，使用半合成的方法可以降低成本，從而利于普及使用。首先合成末端之間有10～14個互補堿基的寡核苷酸片段，退火后以重疊區作為引物，在4種dNTP存在的條件下，通過DNA聚合酶或反轉錄酶的作用，獲得兩條完整的互補雙鏈。合成基因的結構應包括有克隆和表達所需要的全部信號及DNA順序，基因密碼子的閱讀框架也應該同表達體系相適應。此外，由于不同物種的密碼子使用偏好性，在基因合成和克隆時必須考慮這個問題?？赏ㄟ^密碼子優化獲得高效表達。
Q2. 為什么要進行全基因合成？
最常見的獲得目的基因的方法是PCR 擴增釣取基因。但很多的時候，擴增只會得到痕量或根本就得不到目的基因。如果用這種方法，首先，必須準備某一特定組織的cDNA文庫，就必須花時間去準備或訂購。其次，目的基因在文庫中的含量必須充足，否則就可能會找不到合適的方法釣取或克隆得到。第三，PCR擴增得到的目的基因可能會含有許多點突變或單核苷酸多態性，這會給您后期的實驗應用帶來極大麻煩。
Q3. 全基因合成一般服務流程是怎樣的?
(1) 客戶提供所需要合成的基因序列信息，可從百力格公司網站（www.bioligo.cn）下載全基因合成訂單，務必詳細填寫；
(2) 本公司首先將對客戶提供的基因全序列進行軟件分析，檢查基因內部是否含有重復序列及特殊結構，根據序列具體情況設計基因合成方案，并及時回信確認合成信息；
(3) 在得到客戶認可后簽訂基因合成協議，要求客戶支付合成總費用的50％作為預付款；
(4) 本公司收到預付款后立即安排生產，進行引物合成、DNA片段拼接等工作，將全長基因克隆于載體中，通過DNA測序確認合成基因的正確性；對錯誤位點用定點突變方法進行修復，最后得到與客戶提供序列完全一致的基因；
(5) 基因合成結束，通知客戶支付剩余的50％合成款項；
(6) 待客戶付余款之后及時給客戶發貨。
Q4. 合成的基因有長度限制嗎？
可以合成任何長度的基因。
Q5. 密碼子優化有必要嗎？
有必要。不同來源的種屬密碼子的偏好性不同。比如，在人體內受偏愛的密碼子對于E. coli來說可能是稀有的。百力格公司已經為國內外客戶優化了大量的基因，有自主研發的專業軟件?？擅赓M為客戶提供密碼子優化服務。
Q6. 百力格公司的標準免費克隆載體是什么？
(1) pUC系列（pUC18/pUC19/pUC57），pBluescript II SK(+)，PCR2.1等載體：含有若干常用限制性內切酶識別序列；
(2) pTG19-T 載體：適用于T/A克??；另外，本公司還有近300種商業表達載體（如pET系列，pPIC系列）可供基因合成后克隆選擇；若有特殊要求，需換到一些特殊載體或改造過的載體，為方便后續實驗的及時進行，請提供載體及相關的載體信息。
Q7. 百力格公司的合成時間如何?
1500bp以內的常規基因，承諾15個工作日內發貨。
Q8. 為什么基因合成的費用比引物合成高的多?
基因合成包括一個完整的流程：序列分析、優化、引物設計與合成、引物拼接與PCR擴增，PCR產物的T/A克隆，測序篩選，點突變修復、發貨準備等一整套服務，而引物合成只是基因合成工作中的一小部分。如同買一輛汽車與買一堆鐵塊和橡膠是一個道理。
Q9. 基因合成必須要提供基因序列嗎?
是的。您必須提供AA序列或者DNA序列。我們只根據您提供的序列進行基因合成，可以提供免費密碼子優化，但是不提供基因序列的查詢服務。
Q 10. 必須要簽定合同與交納50%預付款嗎?
是的，為保障雙方權利與信譽，應該這么做。
Q 11. 質量如何保證? 時間如何保證?
所有在 百力格合成的基因，都經過100%測序驗證。 百力格公司基因部擁有獨立的分子生物學實驗平臺；本公司引物合成部、測序部，分子生物學試劑盒部，是基因合成部的根本保障?；虿恐鞴軗碛惺暌陨蠈I合成基因的工作經驗，基因合成的工作團隊均經過專業、嚴格的培訓，能保證所承接項目順利進行。
Q12.什么樣的基因是復雜基因?
低GC含量序列：低GC含量的基因序列一般是指全長GC含量低于20%的基因，或100bp以內GC含量少于10%的序列；對于低GC片段，不包含發卡結構、反義互補、重復等其它復雜結構，一般將其分割成200bp/段來合成，然后通過合適的內切限制酶酶切后連接（常用BsaI和BpiI，所以序列本身最好不含有這兩種酶切識別序列），這樣更易得到正確的克隆，但是發貨期將比正常序列更長一些，而且價格也比常規基因稍貴。一般低GC序列都可以合成并可通過測序驗證。
高GC含量：高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以內GC含量高于80%的序列；與低GC序列不同，高GC序列難于測序，所以GC>75%的序列合成業務，請特別詢價，對于此類序列也需要將其分割成300bp的片段來合成，需要合適的內切限制酶，如BsaI 和 BpiI。
反義互補重復序列：由于此類結構序列也不易于測序，所以我們一般不承接反義互補重復序列合成業務。
復雜基因與常規基因相比，合成費用較高，合成時間相對延長。對于復雜基因，可通過密碼子優化，盡量減少基因序列中的重復序列，高GC%區和二級結構區。
Q 13.客戶收到的基因為什么質粒切不動，或切不全?
可能原因如下：
(1)質粒上酶識別序列不正確或者沒有；
(2)酶切反應條件不合適
(3)限制性內切酶對DNA甲基化敏感；
(4)內切酶稀釋不正確或加入方法不正確；
(5)甘油濃度過高；(6) 限制性內切酶已部分或全部失活；
(7)保護堿基引入導致側翼鏈鎖死酶切位點。
對策：
(1)檢查質粒DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。
(2)優化酶反應體系，使用隨酶提供的反應緩沖液；增大酶量或更換新酶。
(3)檢查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否對甲基化敏感。
(4) 更換保護堿基，或PCR擴增目的片段，酶切PCR產物。Q14. 如何運輸以及保存質粒及其菌株？
我們為您提供含有完全正確的基因序列的質粒（不少于5ug）兩管。質?？沙剡\輸，溶解后需－20℃保存，并盡量避免反復凍融。
Q15. 客戶提供樣品做相關服務時，送樣要求有哪些？
質粒樣品，可以是穿刺菌、甘油菌、凍干質?；蛸|粒溶液等形式。
（1)穿刺菌：請提供穿刺培養的單克隆菌落。穿刺培養的菌可以長時間保存而不會導致質粒的拷貝數明顯下降。樣品請在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相應抗生素的固體LB培養基，然后將單菌落用牙簽穿刺于LB固體培養基中。
（2菌液：請將過夜培養的菌液加滅菌甘油至終濃度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中，注意封口，以免污染。（3)質粒：請提供3-5ug溶于無菌去離子水的質粒溶液或者抽干質粒。
（4)注意：
a. 請將裝有樣品的Eppendorf 管口用封口膜封緊，防止運輸途中開蓋導致樣品污染或者丟失。b. 請在管壁上注明質粒名稱及抗性。
c. 載體其他信息請以郵件或便簽等形式告知。
